داروخانه گیاه پزشکی تابنده

 

 

 

 

دانشگاه آزاد اسلامی

 

واحد مرودشت

 

عنوان:

جداسازی قارچ های خاک

(Isolation of soil Fungi)

 

 

استاد مربوطه:

 خانم دکتر بصیر نیا

 

 

 

گرداورنده

 مهندس مرتضی تابنده

 

(کارشناسی ارشد بیماری شناسی گیاهی)

 

تابستان 1392

مقدمه

˜ قارچ چیست؟

قارچ های موجودایت کوچک، عموماً میکروسکوپی، دارای هسته، اغلب
رشته ای، منشعب مولد هاگ و عاری از سبزینه هستند. قارچ ها، دیواره سلولی حاوی کتین و گلوکان (بدون سلولز) به عنوان استخوان بندی دارند که دربستری از پلی ساکاریدها و گلیکوپروتئین ها تثبیت شده اند. گروهی از موجودات شبیه قارچ، یعنی اُاُمیکوتا که اُاُمیست ها نامیده می شوند تا سال 1990 قارچ های حقیقی شناخته
می شدند. با چند استثناء دیواره سلولی غالب اُاُمیست ها دارای گلوکان و مقدار کمی سلولز ولی فاقد کتین است. اُاُمیکوتا در حال حاضر در سلسله کرومیستا قرار دارند نه قارچ ها اما به خاطر زیادی شباهت هایشان به قارچ، حداقل از نظر تولید بیماری در گیاهان، همچنان قارچ در نظر گرفته می شوند.

بسیاری از قارچ ها دارای بدنه رویشی رشته ای به نام میسلیوم هستند. میسلیوم از تمام جهات انشعاب پیدا می کند. هر یک از انشعاب های میسلیوم ریسه نامیده می شود. ضخامت ریسه ها یکنواخت و معمولاً در حدود 2 تا 10 میکرومتر است اما در برخی از قارچ ها ممکن است به بیش از 100 میکرومتر برسد. طول میسلیوم در برخی از قارچ ها فقط چند میکرومتر است اما در بعضی ممکن است به چندین متر برسد (اگریوس، 2005).

 

برای چه از خاک قارچ جدا کنیم؟

 

عده ای ازقارچ های خاک زاد جزو عوامل بیماری زای خطرناک گیاهی بوده که هر ساله خسارات هنگفتی به محصولات کشاورزی وارد کرده و کمبود تولیدات گیاهی از جمله مواد غذایی را باعث می شوند برای جلوگیری از خطرات ناشی از عوامل فوق الذکر، جداسازی، تشخیص و ماطلعه ی آن ها الزامی می باشد.

وقتی که ریشه های گیاه قربانی تهاجم میکروبی می شوند، اغلب جمع آوری سرنخ کافی برای معرفی مستقیم و بدون ابهام مهاجم مشکل می باشد در چنین حالتی و در صورت امکان با در اختیار گذاشتن یک ماده ی غذایی طبیعی یا مصنوعی مناسب برای رشد مهاجم، سعی می کنیم حضور مهاجم را، علی رغم اعمال رقابت از طرف دیگر میکروارگانیسم های خاک آشکار کنیم. پس از آن با تجدید کشت، کشت خالصی به دست آورده که می تواند برای مطالعات بعدی در کلکسیون نگه داری شود. حقیقت این است که از چند سال پیش تکنیک های سریع و مؤثری برای شناسایی عوامل
بیماری زا در محل حمله به وجود آمده است. یک حجم از خاک – حتی اگر کوچک باشد شامل هزاران گونه ی میکروبی متفاوت می باشد. در نتیجه کاری نادرست خواهد بود که سعی شود قارچ های کندرشورا که اغلب فعالیت ساپروفیتی آنها نیز کاهش یافته است، روی محیط کشت های معمولی که به سرعت مورد تهاجم قرار می گیرند به نمایش بگذاریم، در نتیجه باید موادی را پیدا کنیم که رشد قارچ های مورد نظر را تحریک و با رشد رقبای آنها را محدود کرده یا از آن جلوگیری نماید (داوت و راکسل، 2006).

 

استخراج و آماده سازی نمونه خاک

نمونه برداری مرحله ای مهم می باشد. نمونه برداری از خاک های زراعی باید از لایه ی زراعی خاک باشد که به دلیل کاری که روی آن انجام می شود و نیز به دلیل باروری آن به وسیله ی ریشه های مویین گیاهان زراعی اشغال می شود. بنابراین، معمولاً در این لایه که cm40-30 ضخامت دارد به دنبال قارچ های خاک می گردیم. نمونه برداری به کمک و سایلی مثل مته، بیلچه، کاردک که استریل هستند، انجام می شود.

روش متداول مورد استفاده جمع آوری حدود 20 نمونه 500 گرمی در هر هکتار می باشد که در امتداد دو قطر زمین و یا در ناحیه بیمار جمع آوری می کنیم سپس ناخالصی های زنده و غیر زنده ی خاک را از آن جدا می کنیم (سنگ، ماسه و ریشه و چوب).

زمان نمونه برداری

قارچ های خاک این توانایی را دارند که خود را به صورت اندام های استراحتی (اسکلروت، اسپور، کلاسیدوسپور و ...) یا به صورت میسیلیوم (فعال یا غیر فعال) حفظ نمایند در نتیجه نمونه برداری می تواند در زمان های مختلف سال باشد. نمونه برداری در انتهای دوره ی برداشت (خطر تخمین بیش از اندازه) یا در آخر یک دوره ی خیلی خشک (خطر تخمین کمتر از اندازه) توصیه نمی شود.

نمونه باید در دمای حدود 25-20 درجه سانتی گراد خشک شده و سپس در کیسه پلاستیکی جمع آوری و در مکان خنکی (6-4 درجه سانتی گراد) نگه داری
می شوند. ترجیحاً نمونه باید در اسرع وقت مورد استفاده قرار گیرد ولی اگر چند ماه هم نگهداری شود مشکلی ندارد.

 

جداسازی از خاک

دو روش اصلی برای ردیابی حضور قارچ های خاک و جداسازی آنها وجود دارد:

1-  روش مستقیم: رشد پرگنه های قارچ مستقیماً روی یک محیط کشت غذایی کم و بیش انتخابی بدست می آید. برای این کار یا با وارد نمودن خاک در محیط کشت یا به ندرت از طریق فرو بردن محیط کشت متصل به یک قیم در خاک عمل می شود. این روش ها تنها برای قارچ هایی که قادر به رشد ساپروفیتی
می باشند، قابل استفاده است.

2-  روش غیر مستقیم: شامل به طعمه انداختن قارچ در خاک به کمک مواد زنده یا غیر زنده و سپس جدا کردن قارچ از این بستره ها، در زمانی که دوره زندگی قارچ این اجازه را به ما بدهد، می باشد.

روش جداسازی مستقیم عبارتند از:

1-   ترقیق در پتری

2-   وارد کردن مستقیم خاک

 

روش ترقیق در پتری

اساس این کار شامل نگه داری سوسپانسیون خاک در آب سترون و سپس وارد نمودن غلظت متفاوتی از سوسپانسیون در محیط کشت جداسازی می باشد. این روش شامل چندین مرحله بوده که از آماده سازی غلظت ها شروع شده و تا بررسی و تفسیر نتایج ادامه دارد.

غلظت ها با افزایش مقدار مشخصی از خاک که معمولاً 10 گرم به 90 میلی لیتر از آب سترون تهیه شده و سپس با تکان دادن آن برای مدت معلوم که معمولاً 30 دقیقه است ادامه می یابد. این عمل باعث تولید محصولی به غلظت  می شود. برداشت متوالی 10 میلی لیتر از این سوسپانسیون و سپس وارد کردن به 90 میلی لیتر آب سترون دیگر باعث تهیه محلول  می شود و این عمل را چند مرحله تکرار می کنیم که معمولاً تا مرحله ی  پیش می روند باید یادآوری شود که هنگام تهیه کردن نمونه با غلظت های مختلف استفاده از پیت های سترون که باید برای هر دقتی تعویض گردند بسیار مهم می باشد. در مرله تهیه سوسپانسیون اضافه کردن عوامل پخش کننده به سوسپانسیون برای پخش  معلق ماندن ذرات مؤثر است. ما می توانیم از مواد شوینده یا مواد پیچیده تر مشابهی مثلاً کالگون که برای نرم کردن آب استفاده می شود ولی اشکال این کار این است که رشد میسیلیوم ها را کند می کند.

پخش یکنواخت مواد بر روی محیط کشت به وسیله ی چرخاندن آرام آن ها به وسیله ی دست در یک سطح افقی انجام می شود.

ظروف پتری دیش بعد از گذشت یک دوره ی زمانی که ممکن است از 20 تا 20 روز بسته به گونه های قارچ متفاوت است، بررسی می شود.

برخی از محققان عیب این روش را این می دانند که این روش مناسب
گونه هایی است اسپورد در خاک تولید می کنند و حتی تخمین بیشتری از جمعیت آنها به دست می دهد. این در حالی است که همین روش به ضرر قارچ هایی است که به شکل میسلیوم در خاک حاضر بوده و به همین دلیل به ندرت جداسازی می شوند (داوت و راکسل، 2006).

 

آماده کردن محیط کشت جداسازی

قارچ ها در یک محیط مایع خیلی خوب رشد می کنند. با وجود این اگر خواهان مطالعه ی میکروفلوقارچی هم راه با بک بیوتاپ ویژه باشیم، لازم است برای بدست آوردن پرگنه های مجزا از یک کشت جامد استفاده می کنیم. به علاوه باید مراقبت نمود تا پرگنه های قارچ، زمانی که روی مواد غذایی به سرعت در حال رشد می باشند، با همدیگر ادغام نشوند زیرا در غیر این صورت مشاهده و جداسازی آن ها غیر ممکن خواهد بود. از این رو یک محیط کشت جداسازی نباید خیلی غنی از مواد غذایی باشد. گاهی محیط کشت می تواند حاوی بازدارنده های رشد (مواد فعال سطحی) یا حتی (از نظر مواد غذایی) بسیار ضعیف باشد (آب آگار).

یک محیط کشت باید حاوی یک منبع کربن، یک منبع نیتروژن و نیز نمک های مختلف معدنی باشد تا رشد قارچ را باعث شود (داوت و راکسل، 2006).

محیط های کشت پایه برای جداسازی قارچ های خاک کاملاً نامناسب می باشند زیرا که این محیط ها به باکتری ها نیز اجازه رشد می دهند در نتیجه این محیط ها باید به طوری آماده شوند که بدون جلوگیری از رشد قارچ مانع رشد باکتری ها شوند به این هدف می توان از طریق دستکاری pH محیط یا با اضافه نمودن عوامل ضد باکتری های (اسید لاکتیک) به محیط کشت دست یافت.

محیط کشت برای رشد قارچ های مورد نظر باید محیط کشت انتخابی باشد.

محیط کشت انتخابی محیطی است که برای جلوگیری از قارچ ها و باکتری ها و ...

عوامل مزاحم باید موادی از قبیل اسید لاکتیک و قارچ کش ها و ... دیگر مواد به آنها اضافه نمود.

 

قارچ کش ها

از عوامل انتخابی هستند که طور گسترده ای در محیط کشت جداسازی استفاده می شود قارچ کش های دارای طیف تأثیری محدود می باشند، ترکیب می شوند.

قارچ کش های دارای طیف تأثیر وسیع به حذف تمام قارچ هایی کمک
می نمایدن که متعلق به خانواده ها یا رده هایی هستند که از گونه مورد نظر دور
می باشند.

برای مثال برای جداسازی قارچ های اُامیست باید سمسوم کینتوزن و بنومیل که باعث حذف قارچ های با ریسه دیواردار می شود، استفاده نمود.

البته متأسفانه هنوز ترکیبی که دارای طیف تأثیر وسیع علیه قارچ های زیگومیست باشد در دسترس نیست و سم هایمکسازول که بر علیه پی تیوم و آفانومایسس خیلی مؤثر است ولی روی فیتوفترا تأثیری ندارد.

 

وسایل و مواد مورد نیاز:

1-   آب مقطر استریل                           1 لیتر

2-   پودر محیط کشت PDA                39 گرم

3-   دینرجنت                                    3-2 قطره

4-   پتردیش 6 سانتی متری جهت ریختن محیط کشت

5-   لوله آزمایش استریل جهت تهیه سوسپانسیون

6-   دستگاه اتوکلاو برای استریل کردن لوله ها و آب مقطر

7-   پیت استریل برای برداشت سوسپانسیون و انتقال به محیط کشت.

8-   اسکارپر برای جداسازی کلنی های قارچ و خالص سازی آنها.

 

روش کار

محیط کشت مورد استفاده محیط کشت عصاره سیب زمینی و دکستروز و آگار (PDA) + دیترجنت

برای ساخت محیط کشت 39 گرم از پودر محیط درون 1 لیتر آب مقطر مخلوط کرده و سپس توسط دستگاه اتوکلاو استریل نموده و سرد می کنیم و پس از سرد شدن مقدار 2 قطره دیترجنت به محلول محیط اضافه می کنیم، محلول را درون ظروف (پتری دیش) نگاه داری می کنیم.

 

تهیه سوسپانسیون خاک

مقدار 10 گرم خاک را درون 90 میلی لیتر آب مقطر استریل ریخته و محلول  ساخته و سپس مقدار 10 میلی لیتر از محلول مورد نظر را درون 90 میلی لیتر آب مقطر استریل دیگر ریخته و محلول  بدست می آید و سپس مقدار 10 میلی لیتر از محلول مورد نظر را درون 90 میلی لیتر آب مقطر استریل ریخته و محلول  بدست می آید.

 

 

کشت دادن سوسپانسیون خاک بر روی محیط کشت

برای کشت روی محیط کشت از محلول  و  استفاده می کنیم. از هر محلول مقدار cc5/0 در هر محیط کشت ریخته و به آرامی تکان می دهیم تا محلول به صورت یکنواخت روی محیط را بپوشاند. در نوبت اول نمونه اول تهیه شده از خاک مزارعه روستای حاجی آباد نقش رستم را کشت دادیم، به تعداد 2 عدد پتری دیش از هر نمونه ( و )، چهار روز بعد بازرسی از نمونه و نتیجه به دلیل رشد بیش از د رایزوپوس قابل استفاده نبود و منجر به حذف کل نمونه ها شد (شکل 4، پیوست آخر).

در نوبت دوم، کشت دوباره نمونه اول به تعداد 2 عدد پتری دیش از هر نمونه ( و )، دو روز بعد، بازرسی از نمونه و نتیجه: به دلیل رشد بیش از حد رایزوپوس قابل استفاده نبود (شکل 6، پیوست آخر)

نمونه دوم: تهیه شدن با خاک روستای فیروزی، واقع در 2 کیلومتری شهرستان مرودشت.

در نوبت اول، نمونه دوم تهیه سوسپانسیون از خاک نمونه دوم و کشت به تعداد 2 عدد پتری دیش از هر نمونه ( و ).

سه روز بعد، بازرسی نمونه ها و حذف نمونه ها به دلیل رشد بیش از حد رایزوپوس (شکل 7، پیوست آخر).

نمونه سوم: تهیه شده از خاک مزرعه ای در کنار شهر شیراز که زیر کشت سبزی است.

در نوبت اول نمونه سوم، تهیه سوسپانسیون با خاک نمونه سوم و کشت به تعداد 2 عدد پتری دیش از هر نمونه ( و ).

چهار روز بعد، بازرسی نمونه و نتیجه:

§        تشکیل کلنی های جدا از هم قارچ ولی پوشیده از ایزوپوس.

§        تشکیل کلنی های متعدد ولی در کنار مقدار رایزوپوس در گوشه پتری دیش.

§        کاملاً پوشیده از رایزوپوس.

§        تشکیل کلنی های جدا از هم قارچ و باکتری در کنار هم.

§       نمونه های   حذف شدند به دلیل وجود رایزوپوس.

§   نمونه  که حاوی کلینی های جدا از هم قارچ و باکتری در کنار هم بود خالص سازی شد، پس از یک هفته (شکل 8، پیوست آخر)

4 قارچ خالص سازی شده به صورت جدا از هم روی پتری دیش های جدا رشد کرده و نتیجه تقریبی (تشخیص با چشم):

·       قارچ سفید رنگ  فوزاریوم (شکل 12، پیوست آخر)

·       قارچ سیاه رنگ  اسپرژیلوس (شکل 10، پیوست آخر)

·       قارچ زرد رنگ  اسپرژیلوس (شکل 11، پیوست آخر)

·       قارچ سبز رنگ  پنی سیلیوم.

مرحله ی دوم: خالص سازی از قارچ های سفید رنگ و زرد رنگ و تهیه کلنی خالص از این قارچ ها پس از یک هفته.

 

 

نتیجه

 

خاک منطقه ی حاجی آباد و فیروزی از روستاهای شهرستان مرودشت به دلیل وجود زیاد اسپور رایزوپوس و رشد سریع این قارچ و جلوگیری از رشد دیگر قارچ ها در محیط کشت برای استفاده مناسب نبوده و به همین دلیل برای جداسازی قارچ از خاک بدون استفاده از سموم دفع رایزوپوس مناسب نیست، خاک منطقه ی شیراز خاک مناسبی بود چون هم مدقار رایزوپوس این خاک کم بود و هم تعداد کلنی های تشکیل شده از این خاک مناسب بود.

تعداد قارچ های جدا شده و شناسایی شده به عبارت زیر است:

1-   قارچ سفید رنگ، قارچ فوزاریوم Fusariun spp

2-   قارچ زرد رنگ، قارچ آسپرژیلوس Aspergillus spp

3-   قارچ سیاه رنگ، قارچ آسپرژیلوس Aspergillus spp

4-   قارچ سبز رنگ، قارچ پنی سیلیوم Penicillium spp

5-   رایزوپوس Rhizopus spp

6-   قارچ ناقص پیکنیددار که شناسایی نشد (شکل 13، پیوست آخر).

 

 

بیماری ها و تأثیراتی که این قارچ ها بر روی گیاهان و به زندگی انسان ایجاد می کنند:

·       Rhizopus spp بیماری پوسیدگی نرم میوه و سبزی، کپک نان.

·       Aspergillus spp (شکل 18، پیوست آخر)

·       عامل بیماری پوسیدگی بذر، کپک نان.

·       Fusarium spp

·       بیماری پژمردگی آوندی

·       Penicilliun spp (شکل 17، پیوست آخر)

·       برای استخراج پادزهر پنیسیلیوم برای مقابله با باکتری ها.

به صورت آزمایشی و به دلیل نبود سم pcmb در بازار و به خاطر مشکلاتی که قارچ رایزوپوس ایجاد کرده بود از سم تبوکنازول درون محلول محیط کشت استفاده
می کنیم.

تهیه محیط کشت انتخابی که حاوی مواد زیر است در تاریخ 30/8:

1-     39 گرم پودر PDA در یک لیتر آب مقطر، 2 گرم سم تبوکنازول 2% ، اسید الکتیک 50% به مقدار 30 قطره (برای کنترل باکتری ها) و دیترجنت 2 قطره (شکل 5، پیوست آخر).

2-     1/9 کشت سوسپانسیون حاوی خاک نمونه سوم به تعداد 2 عدد پتری دیش از هر نمونه ( و ) (شکل 1، پیوست آخر).

نتیجه: هیچ یک از نمونه ها قارچی را در هفته ی اول نشان نداد. (شکل 2، پیوست آخر)

2 هفته بعد: نمونه ی  کلینی ها از یک قارچ سفید رنگ در حال رشد هستند.

قارچ ها در این محیط کشت به صورت ریسه های هوایی رشد کرده و تشکیل کلنی نمی دهند در حالی که در محیط کشت قبلی (PDA)  به صورت کلنی های روی سطح محیط رشد می کنند.

در هفته ی دوم قارچ پنیسیلیوم هم شروع به رشد کرد و پس از آن قارچ های دیگر و به ندرت رایزوپوس شروع به رشد کردند.

کشت خالص رایزوپوس روی محیط کشت و نتیجه آن تشکیل کلنی ثابت و ریسه های هوایی توسط قارچ به رنگ سفیدرنگ (شکل 9، پیوست آخر) و رشد قارچی که به صورت کامل شناسایی نشد (نبود کلید)، قارچ پیکنیدیوم و از سری قارچ های ناقص است.

در این محیط قارچ آسپرژیلوس سیاه رنگ اصلاً رشد نکرده و ثابت باقی مانده است، ولی گونه ی زرد رنگ تشکیل ریسه داده ولی در این قارچ هم به صورت پودری که در محیط ساده رشد کرده بود، رشد نکرد، پس به احتمال زیاد از غلظت های مختلف این سم می توان برای کنترل آسپرژیلوس در روی محیط های کشت جلوگیری شود.

مقایسه رشد:

1-   آسپرژیلوس سیاه رنگ روی دو محیط (شکل 15، پیوست آخر).

2-   آسپرژیلوس زرد رنگ روی دو محیط (شکل 3، پیوست آخر).

3-   فوزادیوم روی دو محیط (شکل 16، پیوست آخر).

 

منابع و مآخذ:

 

1-  داوت و راکسل، پییرو فرانسیس. (2006). ردیابی و جداسازی قارچ های خاک. ترجمه: رضا فرخی نژاد و سید علی موسوی جرف، انتشارات دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، چاپ اول.

2-  اگریوس، چرج ان. (2005). بیماری شناسی گیاهی. ترجمه: کرامت اله ایزدپناه و سید محمد اشکان، ضیاء الدین بنی هاشمی، حشمت الله رحیمیان و واهه میناسیان، انتشارات آییژ، تهران: چاپ اول.