داروخانه گیاه پزشکی تابنده

  جداسازی باکتری ها (پروکاریوت ها)

 

 

تهیه کننده:

 مهندس مرتضی تابنده بخت

 

 

 

 

(کارشناسی ارشد بیماری گیاهی)

پاییز 1389

مقدمه:

باکتری ها و مولیکوت ها، پروکاریوت و عموماً ریز موجوداتی تک سلولی هستند که ماده ژنتیکی (DNA) آنها با غشا محصور نیست و بنابراین به شکل هسته سازمان نیافته است. سلول های این ریز موجودات متشکل از سیتوپلاسم حاوی DNA و ریبوزوم های کوچک (S70) است. در مولیکوت ها سیتوپلاسیم فقط با لایه ای از غشای سلولی محدود شده است ولی باکتری ها افزون بر غشا، دیواره سلولی نیز وجود دارد. تمام موجودات دیگر (یوکاریوت ها) دارای اندامک های سلول واجد غشا (هسته، میتوکندری در گیاهان – کلروپلاست) است. یوکاریوت ها دو نوع ریبوزوم دارند: ریبوزوم بزرگتر (S80) در سیتوپلاسم خود و ریبوزم کوچک تر (S70) در میتوکندری و در کلروپلاست. در واقع اندامک های سلول پوکاریوت و پروکاریوت ها ویژگی های مشترک بسیاری دارند. برای مثال بعضی از آنتی بیوتیک ها مؤثر بر باکتری ها از فعالیت میتوکندری یا کلروپلاست ها جلوگیری می کنند ولی بر فعالیت در دیگر سلول های یوکاریوتی گیاهی اثر ندارد.

 

بیماری های ناشی از باکتری ها در گیاهان

حدود 1600 گونه باکتری تاکنون شناسایی شده است. بیشتر این گونه ها صرفاً پوده رست هستند و چون مقادیر خارق العاده ای از مواد آلی زائد که سالانه انسان، جانوران و کارخانه ها تولید می کنند یا با مرگ جانوران و گیاهان به وجود می آید، تجزیه خواهند کرد، برای انسان سودمند شمرده می شوند. چندین گونه باکتری در انسان بیماری زا هستند و بیماری های سل، ذات الریه و حصبه را باعث می شوند و چندین گونه دیگر نیز موجب بیماری هایی در حیوانات از جمله تب مالت و سیاه زخم
می شوند. در حدود 100 گونه باکتری در گیاهان بیماری ایجاد می کنند. اکثر باکتری ها  بیماری زا در گیاهان، پوده رست های اختیاری و قابل کشت در محیط های غذایی هستند؛ ولی باکتری های آوندی سخت رشد را به دشواری می توان در محیط های کشت پرورش داد و بعضی از آنها هنوز قابل کشت نیستند. باکتری ها ممکن است
میله ای شکل، کروی، مارپیچی یا رشته ای (نخ مانند) باشند. بعضی از باکتری ها
می توانند در محیط های مایع با تاژک خود حرکت کنند، در حالی که بسیاری دیگر تاژک ندارند و قادر به حرکت نیستند. برخی قادرند به اسپور تبدیل شوند و باکتری های رشته ای[1] توانایی تولید اسپوری به نام کنیدی در انتهای رشته خود دارند. باکتری های دیگر اسپور تولید نمی کنند و اغلب انواع باکتری ها در مرحله رویشی با تقسیم شدن ساده تولید مثل می کنند. باکتری ها با سرعت فوق العاده ای تکثیر می یابند و اهمیت آنها به عنوان بیمارگر عمدتاً به توانایی آنها در تولید تعداد بی شماری سلول در یک دوره زمانی کوتاه برمی گردد. بیماری های باکتریایی گیاهی در هر محل گرم و مرطوب دیده می شوند و همه انواع گیاهان را تحت تأثیر قرار می دهند. بیماری های باکتریایی به ویژه در نواحی حاره ای متداول و شدیدند ولی در شرایط آب و هوایی مساعد در هر محل می توانند مخرب باشند.

 

شناخت علائم اختصاصی بیماری های باکتریایی

باکتری ها چون سایر پاتوژن های گیاهی روی میزبان های مختلف خود ایجاد
نشانه های گوناگون بیماری چون بلایت، گال، شانکر، زردی، اسکاب، موزائیک، پوسیدگی، کوتولگی و غیره می کنند. اما آشنایی و دقت در سه نشانه اختصاصی
باکتری ها امر تشخیص صحیح و سریع، عامل باکتریایی را تا اندازه ای آسان می سازد:

1-  آب گز یا آبسوختگی: این نشانه بیماری به صورت هاله های آبسوخته در اطراف لکه های نکرتیک خصوصاً بر روی برگ و شاخه های جوان قابل رؤیت
می باشد.

2-   زاویه بودن: نشانه های نکروتیک عموماً به حالت غیر منظم و زاویه ای می باشند.

3-  تراوشات باکتریایی: بیوفیلم ها و یا تراوشات باکتریایی که از احاطه شدن
سلول های باکتریایی در لایه مواد پلی ساکاریدی به وجود می آید، غالباً در محل شانکرهای شاخه و تنه اصلی گیاهان و نیز در محل روزنه ها، عدسکها، نکتارها و روزنه های آبی مشاهده می گردد. تراوشات مذکور عامل مهم اتصال، بقا و انتشار باکتری می باشد.

 

شناخت میزبان

شناسایی باکتری ها به روش غیر مستقیم شناخت گیاهان میزبان آنها مهم، مؤثر و قابل اطمینان می باشد. به ویژه در مواردی که منبع و مأخذ اصلی ایزوله باکتریایی نامشخص باشد و یا باکتری مورد مطالعه به گونه هایی چون X.campest و P.syrinage تعلق داشته باشند که تنوع پاتروارها و به تبع آن دامنه میزبانی در آنها بسیار است. در این موارد بخصوص شناسایی سریع باکتری ها در سطح زیر گونه و پاتووار جز از طریق شناخت میزبان به آسانی امکان پذیر نمی باشد.

شاید ذکر این مطلب در این جا حائز اهمیت باشد از روش های سریع جداسازی و اثبات بیماری زایی انواع باکتری های گیاهی، پاشش سوسپانسیون باکتری هدف به بافت سالم میزبان اولیه در غلظت  سلول در هر میل و در خصوص باکتری های عامل پوسیدگی، تلقیح ریشه هویج در غلظت  سلول در هر میل است.

 

نحوه نمونه برداری

نمونه برداری به شیوه صحیح یکی از مراحل مهم در امر جداسازی و شناسایی باکتری ها می باشد. به طور کلی در تهیه نمونه های آلوده گیاهی توجه به مسائل و موارد زیر ضروری می باشد:

1-   نمونه برداری آلوده مملو از جمعیت باکتری باشند.

2-   باکتری ها در اوج فعالیت بیماری زا باشد.

نمونه های تهیه شده از اندام های نیمه سالم و نیمه آلوده و حائز نشانه های تیپیک بیماری باشند. زیرا امکان جداسازی باکتری از نمونه های گیاهی کاملاً خشک، پوسیده و یا دارای نشانه هایی پیشرفته بیماری به آسانی میسر نمی باشد. در واقع بین سن علائم بیماری با جمعیت باکتری تناسب مستقیم وجود دارد. از این رو، کشت این نمونه­ها تنها روی محیط کشت اختصاصی و یا کشت های چند مرحله ای امکان پذیر می باشد.

در نمونه های کاملاً آلوده به دلیل سریع الرشدی میکرو ارگانیسم های ساپروفیت و نیز کاهش اکسیژن و مواد غذایی، امکان رقابت، بقا و رشد از باکتری پاتوژن سلب
می گردد. بنابراین برای حفظ نمونه های جمع آوری شده ضروری است نمونه های گیاهی در داخل کیسه های پلاستیکی و ترجیحاً در یخچال های سیار به آزمایشگاه منتقل و به سرعت کشت گردند.

 

تهیه سوسپانسیون

حد فاصل ناحیه آلوده و سالم بافت گیاهی که دارای نشانه های تیپیک بیماری است انتخاب و پس از شستشوی سطح با آب (در مورد نمونه های تازه و بهاره) و شستشو و ضدعفونی سطح با آب ژاول یا وایتکس تجاری 1%و یا الکل سفید 85-70% به مدت 3 دقیقه شستشوی مجدد با آب (در مورد نمونه های زمستانه)، قطعات بسیار کوچک از نمونه های فوق تهیه می شود. روش های دیگر، تهیه عصاره از نمونه های آلوده از طریق هاون کردن نمونه های برگی است. سوسپانسیون های فوق به لوله های استریل حاوی 5 میل آب مقطر استریل منتقل و پس از تهیه رقیق مناسب یک قطره از آن را روی محیط کشت های عمومی کشت می گردد.

 

در این مورد نیز اشاره به چند نکته زیر ضروری به نظر می رسد:

1-  نمونه های گیاهی که احتمال داده می شود جمعیت باکتری در آن اندک باشد و یا باکتری مورد نظر به مواد ضدعفونی کننده حساسیت داشته باشد و یا باکتری خاص ممکن است در اثر ضدعفوین بافت حساس گیاهی چون نمونه برداری برگ از بین برود، در این گونه موارد، ضد عفونی نمونه توصیه نمی شود.

2-  اندام های آلوده گیاهی که دارای تراوشات و صمغ باکتریایی هستند و امکان جداسازی باکتری ها از آن ها بطور مستقیم مقدور نیست، توصیه شده است.

این گونه نمونه ها پس از شستشو و ضد عفونی، در یک محیط مرطوب چون دیسکاتور قرار داده شوند تا باکتری در بافت آلوده شروع به فعالیت مجدد کنند و پس از آن سوسپانسیون لازم تهیه و روی محیط کشت مناسب کشت شوند. در این روش، کلنی باکتری ها به ظاهر خالص می باشند.

دو نکته مهم دیگر که بسیار هم حائز اهمیت می باشند، عبارتند از:

الف) رعایت نکات ایمنی آزمایشگاهی بویژه در تهیه سوسپانسیون ها.

به طور کلی، همه باکتری هایی که روی محیط کشت قابل کشت هستند،
می­توانند بطور بالقوه برای انسان مخاطره آمیز باشد.

ب) خلوص کشت های باکتریایی لازمه تشخیص صحیح آنهاست.

علاوه بر آن، لازم است از کشت مکرر یک ایزوله باکتریایی اجتناب گردد. زیرا کشت های مجدد در مواقعی موجب تغییر در ژئوتیپ باکتری می شوند.

 

محیط کشت های عمومی

در مطالعه صفات مورفولوژیکی باکتری ها بویژه مورفولوژی کلنی ها انتخاب محیط کشت مناسب نقش بسزایی دارد. برای کشت باکتری ها از جمله باکتری های گیاهی، انواع مختلف از محیط کشت مورد استفاده قرار می گیرند:

1- محیط کشت (Nutlient agar) NA

محیط کشت عمومی برای اکثر باکتری های بیماری زای گیاهی که از مواد زیر تشکیل شده است:

 

هدف: جداسازی باکتری که باعث بیماری در گیاهان می شوند و انجام آزمایشات مختلف روی آنها همچنین شناسایی باکتری و جلوگیری از خسارت های آنها.

وسایل مورد نیاز:

1-   اتوکلاو یا دیگ تحت فشار: برای استریل کردن مایعات استفاده می شود.

2-   هودلامینار ایرفلر: (محیط عاری از پاتوژن های ناخواسته)

اشعه U.V در هود باعث از بین بردن پاتوژن های ناخواسته می شود. این نکته را باید در نظر داشت که به هنگام روشن کردن اشعه U.V کسی اطراف هود نباید باشد چون اشعه سرطان زا می باشد. و با جریان هوایی که در هود وجود دارد از ورود
پاتوژن ها به داخل و همچنین برعکس جلوگیری می کند.

3-  چراغ الکلی: برای استریل کردن برخی از وسایل مانند لوپ، انبرک و غیره، همچنین به هنگام جداسازی و خالص سازی باکتری باید پتری دیش در نزدیکی شعله باشد تا از ورود پاتوژن های ناخواسته جلوگیری کند.

4-   حوله کاغذی استری: بعد از ضد عفونی سطحی و شستشوی بافت به وسیله حوله رطوبت آن را می گیریم.

5-   مواد ضدعفونی (هیپو کلرید سدیم نیم درصد در یک لیتر آب): برای ضد عفونی.

6-   الکل: برای ضدعفونی برخی از وسایل همچنین میز کار یا هود.

7-   آب مقطر استریل cc5: برای تهیه سوسپانسیون.

8-   ظروف  کشت: پتری دیش 6 سانتی استریل شده برای ریختن مایع (NA) و تهیه محیط کشت.

9-   پودر NA: برای تهیه محیط کشت عمومی.

10- ترازو: برای وزن کردن 20 گرم پودر NA

11- سایر وسایل دیگر نظیر: ارلن، انبرک، بشر، دیترجنت، سوزن، لوپ و اسکالپل.

نکته: تمام وسایل مورد استفاده باید استریل شده باشد برای جلوگیری از پاتوژن های ناخواسته.

 

مهیا کردن برخی وسایل قبل از جداسازی:

1-   استریل کردن پتری دیش وسایل دیگر مورد استفاده در آزمایشگاه.

2-   درست کردن محلولی برای ضدعفونی سطحی که با بیمارگر اصلی تعارض دارد.

این کار به دو روش انجام می شود:

1-   بردن بافت آلوده در محلول (غوطه ور کردن)

2-   کشیدن محلول بر سطح بافت آلوده.

 

انواع محلول ضدعفونی کننده:

1-   متداول ترین محلول ضد عفونی کننده هیپولکریت سدیم نیم درصد در یک لیتر آب است.

2-   اتیلیک 70% استفاده می شود.

ضمناً مدت زمانی که بافت باید در محلول ضدعفونی باشد بستگی به نوع بافت دارد اگر بافت نرم بود کمتر از 30 ثانیه و اگر بافت سخت بود تا 30 ثانیه باید در محلول غوطه ور باشد.

3-  استریل کردن آب مقطر برای تهیه سوسپانسیون که مقداری cc5 آب مقطر در لوله آزمایشگاه ریخته و درب آن را محکم با پنبه محکم می کنیم و آن را در اتوکلاو در دمای 120 درجه سانتی گراد و فشار At15 اتمسفر به مدت 20 دقیقه گذاشته تا استریل شود. ضمناً به هنگام باز کردن اتوکلاو مطمئن شود که فشارسنج صفر درجه را نشان داده یا اینکه تمام بخار اتوکلاو خارج شده باشد. (برای استریل کردن سعی شود همراه با مایع NA با هم انجام داده تا فقط با یک بار خاموش و روشن کردن اتوکلاو همه وسایل و مواد را استریل کنیم).

4-   آماده کردن محیط کشت Nutrient agar (NA).

برای درست کردن (NA) مقدار g20 پودر آماده NA را با یک لیتر آب مقطر درون الرن ریخته و ارلن را تکان داده تا کاملاً NA حل شود بعد آن را (همزمان با استریل کردن آب مقطر می توان مایع NA را استریل کرد) و بعد از استریل کردن مایع NA در اتوکلاو آن را بیرون آورده و مدتی صبر کرده تا خنک شود. تا دمای آن به 40 الی 45 درجه سانتی گراد برسد (به طوری که اگر درست بر روی ارلن گذاشتیم احساس سوختگی نداشته باشیم) و بعد زیر هود شروع به ریختن مایع (NA) درون پتری دیش در حضور شعله می کنیم: حتماً قبل از ریختن می توان برای جداسازی کلنی ها مجزای باکتری ها از دو قطعه دیترجت استفاده کنیم. سپس بعد از خنک شدن مایع NA در پتری دیش محیط کشت جامد شده و آماده کشت باکتری می شود.

 

انتخاب بافت آلوده که عامل بیماری آن باکتری است.

همانطور که قبلاً گفته شد بیماری های باکتریایی بیشتر با بوی بد بافت ها و آبکی شدن آنها قابل تشخیص است. بعد از تشخیص بافت ما پیاز و سیب زمینی بود پیدا کرده و در یخچال گذاشته و سریعاً به آزمایشگاه برای جداسازی باکتری و تهیه سوسپانسیون جداسازی باکتری انتقال می دهیم.

 

1- تهیه سوسپانسیون: ابتدا بافت های آلوده را به وسیله الکل ضدعفوین سطحی دادیم و بعد از آن به کمک اسکالپل و انبرک استریل قسمتی از بافت، پیاز و (سیب زمین) که هم دارای بافت سالم و هم دارای بافت بیمار است (حد فاصل ناحیه آلوده و بیمار) را جدا کرده و در (هیپوکلریت سدیم نیم درصد در یک لیتر آب) مادۀ ضد عفونی غوطه ور کردیم به مدت 30 ثانیه و سپس در آب مقطر شستشو دادیم و روی حوله کاغذی استریل گذاشته و پس از این که رطوبت خود را از دست داد، ریز ریز کرده و در آب مقطر استریل ریخته و به مدت لازم (بستگی به بافت دارد اگر بافت نرم 2 ساعت و اگر بافت سخت بود تا 24 ساعت) می گذاریم و سوسپانسیون آماده کشت می شود.

2- کشت مستقیم: ابتدا سطح بافت سیب زمینی و پیاز را ضدعفونی کرده و بعد قسمتی از سطح بافت برداشته و با استفاده از لوپ استریل آن را به محیط کشت انتقال می دهیم.

 

کشت باکتری:

کشت با استفاده از سوسپانسیون: در زیر هود لوپ را استریل کرده (برای استریل کردن لوپ آن را در الکل زده و روی شعله گرفته تا لوپ سرخ شود) و بعد از آن لوپ را در محیط کشت (NA) خنک کرده و در سوسپانسیون فرو کرده و بعد لوپ را به آرامی (طوری که محیط کشت زخم نشود) از یک سمت محیط کشت شروع کرده و دو عدد خط می کشیم. و بعد دوباره لوپ را در استریل خنک کرده و از انتهای دو خط به طوری که عمود بر دو خط قبل خطی کشید به سمت پایین و سپس از انتهای خط دومی که به سمت پایین کشیدیم خطی دیگر به صورت عمود بر خط دوم کشید، علت این کار این است که تراکم باکتری ها را کاهش داده تا بتوان برای خالص سازی از یک کلنی جداگانه استفاده شود.

این مراحل را جداگانه هم برای سیب زمینی و برای پیاز انجام می دهیم.

2- کشت مستقیم

بعد از ضدعفونی سطحی و برداشتن لایه ای از سطح بافت آلوده لوپ را استریل و به ترتیبی که در مرحله قبل گفته شد در محیط کشت  (NA) خط می کشیم. ضمناً تمام وسایل باید در هر دو مرحله استریل و زیر هود انجام شود.

 

خالص سازی باکتری:

بعد از کشت باکتری ها به مدت چند روز صبر می کنیم و سپس دوباره با استفاده از لوپ استریل شده زیر هود و در نزدیکی شعله از هر کلنی باکتری که از نظر رنگ و شکل متفاوت است، کشت مجدد و خالص می کنیم.

 

- باکتری جداسازی شده از برنج

در آزمایشگاه درس قارچ من برای جداسازی قارچ از بذر برنج بدون پوست دوباره کشت تکرار کردم که در هر دو بار باکتری مانع از رشد قارچ شود و هم چنین در تکرار دوم من از اسید لاکتیک استفاده کردم برای جلوگیری از رشد باکتری اما دوباره دو نوع باکتری رشد کرد که من آن ها را خالص سازی و برای انجام آزمایش بعد از آنها هم استفاده کردم.

بعد از خالص سازی باکتری 4 نوع باکتری خالص سازی شد و چون باکتری های کشت شده کهنه شده بودند، کشت مجدد داده و برای انجام آزمایش واکنش کاتالاز و گرم آماده کردم، چون برای انجام واکنش ها باید کلنی باکتری جوان باشد.

 

مراحل واکنش گرم:

برای استفاده از این روش از هیدروکسید پتاسیم (KOH) 3% استفاده می کنیم. KOH دیواره را به صورت لایه لایه حل می کند. برای تفکیک باکتری های گرم منفی و گرم مثبت از یکدیگر به این ترتیب عمل می کند. باکتری گرم منفی (G^-) تعداد
لایه های کمتری در اطراف پروتوپلاسم دارند به همین دلیل در یک زمان مشخص مثلاً 1 دقیقه در نظر می گیرند در طول این یک دقیقه چهار لایه از باکتری گرم منفی و 4 لایه از باکتری گرم مثبت (G⁺) از بین می رود. در باکتری گرم منفی KOH به پروتوپلاسم می رسد و غشا از بین رفته و ماده لزجی در محیط مشاهده می شود. اگر یک چوب کبریت را به پروتوپلاسم بزنیم پروتوپلاسم کش می آید، ولی در باکتری گرم مثبت هنوز لایه هایی در اطراف پروتوپلاسم باقی مانده و محیط لزج نمی گردد.

·       در صورت کش آمدن باکتری  گرم منفی

·       در صورت کش نیامدن باکتری  گرم مثبت

 

مراحل واکنش کاتالاز

برای انجام آزمایش فوق یک کلنی از باکتری کشت شده روی اسلاید گذاشته، مقدار یک قطره   (1 میل آب اکسیژنه 3%) اضافه می کنیم. در صورت پدید آمدن حباب گاز در سطح کلنی، باکتری کاتالاز مثبت و اگر حباب درست نشد کاتالاز منفی می باشد:

                                            اکسیژن + آب                 (آب اکسیژه 3%)

علت تشکیل حباب خارج شدن گاز ₂O می باشد:

·       تشکیل حباب  کاتالاز مثبت

·       فاقد حباب  کاتالاز منفی

نتیجه گیری

 

 

منابع و مآخذ:

- دکتر. ن. حسن زاده، 1334، شناسایی و طبقه بندی باکتری های بیماری زای گیاهی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات، ص 523.

- جرج ان. اکریوس، 2005، بیمارشناسی گیاهی 3، تهران آییژ، چاپ اول،