داروخانه گیاه پزشکی تابنده

 مکانیسم PTGS :

کشفیات چندسال اخیر باعث شفاف تر شدن مکانیسم RNAi شده است.باتوجه به نتایج این تحقیقات که از آزمایش هایی برروی موجودات زنده و در محیط Invitro بدست آمده است در مدل های ارائه شده برای   PTGS دو مرحله وجود دارد:

در مرحله آغاز یک ترکیب نوکلئازی(Dicer) به dsRNA های بزرگ متصل می شود و آنها را به قطعات ۲۱ تا ۲۵ نوکلوتیدی siRNA   (small interfering RNA)مجزا برش می دهد. در مرحله دوم این siRNA ها به کمپلکس آنزیمی RISC اتصال پیدا می کنند و باعث تخریب mRNAهای تک رشته ای همولوگ با خود می شوند.(تصاویر٤،٥،٦)

۷-۱-۲-۲ : تبدیل dsRNA به siRNA :

 با مطالعه PTGS در گیاهان شواهدی بدست آمد که نشانگر نقش داشتن  RNA های کوچک در فرایند RNAi بودند.Hamilton (1999) با مطالعه بر روی ترانسژن های القاء کننده PTGS در گوجه فرنگی که با ژن  acoترا ریخت شده بودند, تجمع  RNAهای کوچک از aco با طول 25 نوکلوتید را مشاهده کرد.دراین مطالعه  RNAهای 21 تا 23 نوکلوتیدی دارای همولوژی با ژن مذکور سنتز شده و به درون سلول وارد شدند که باعث تخریب mRNA مشابه گردیدونقش RNA کوچک مشخص شد. در آزمایش هایی که برای شناسایی siRNA بعنوان عامل اصلی RNAi انجام می شد. محققین به دنبال پیدا کردن پلی پپتیدی بودند که توانایی تولید این چنین مولکول هایی را داشته باشد و در نهایت آنزیم RNase III در Ecoli شناسایی شد. اندو نوکلئاز RNaes III در تخریب dsRNA و تولید siRNA نقش مهمی را داراست. آنزیم RNase III به صورت شطرنجی هر دورشته dsRNA را برش می دهد و در ناحیه َ3 یک انتهای دو نوکلوتیدی بوجود می آید.

. اولین مدارک برای شرکت RNaseIII در RNAi توسط گروه T.Tuschls فراهم آمد . آنها توالی های ۲۱ تا ۲۳ نوکلئوتیدی  RNAهای تولید شده در فرآیند شکستن dsRNA را در سیستم آزاد سلولی در Drosophila مورد تجزیه و تحلیل شیمیایی قرار دادند آنها حضور انتهایphosphate ´5 hydroxyl´3 و ´ 3با دو نوکلئوتید آویزان را نشان دادند .

نقش siRNA در RNAi بطور قطعی زمانی ثابت شد که Elbashir و همکارانش نشان دادند که وقتی  RNA های دو رشته ای سنتز شده دارای ۲۱ تا ۲۳ نوکلئوتید به سیستم سلولی اضافه می شوند قادرند منجر به تخریب  mRNAهای همولوگ با خودشان شوند. siRNA هایی که در آزمایشگاه تولید می شوند به نوبه خود زمانی که بصورت ژن خارجی به شیره سلولی Drosophila اضافه می شوند به طور خاص تخریبmRNA را القاء می کنند. تعدادی از مطالعات Invivo و Invitro نشان داده اند که تولید RNA های ۲۱ تا ۲۳ نوکلئوتیدی از dsRNA نیازمند ATP است . اخیراً Nykanen و همکارانش (165) میزان ATP را در عصاره های سلولی Drosophila کاهش دادند و کاهش قابل توجهی را در میزان تولید siRNA در عصاره سلولی Drosophila مشاهده کردند . این آزمایشات پیشنهاد می کنند ATP میزان تولید siRNA را کنترل می کند .

ممانعت از بیان ژن خاص توسط این siRNA ها همچنین در بسیاری از سیستم های بی مهرگان و مهره داران مشاهده شده است. اخیراً schwarz و همکارانش  مدارک بیوشیمیایی مستقیمی بدست آورده اند که siRNA ها می توانند به عنوان RNA  راهنما جهت تخریب mRNA  همولوگ با خودشان عمل کنند.

۸-۱-۲-۲ : تکثیر و انتقال سیستمیک siRNA:

یکی از جنبه های مهم RNAi, طبیعی بودن فعالیت این پدیده می باشد. چند ملکول dsRNA برای تخریب پیوسته mRNA رونویسی شده برای مدت زمان طولانی کافی می باشد. موتاسیون در ژن رمزکننده RdRp نشان داد این آنزیم نقش مهمی را در تکثیر عوامل ایجاد کننده RNAi بر عهده دارد. تکثیر siRNA ممکن است در مراحل مختلف واکنش RNAi اتفاق بیفتد که این موضوع در گیاهان, C.elegans و قارچ نوروسپورا نشان داده شده است. اما در پستانداران و مگس سرکه اثبات نشده است. در کنار تشکیل siRNA یک ویژگی جالب خاموشی ژن براساس همولوژی این است که تعداد مولکولهای dsRNA که القاء کننده خاموشی هستند ثابت نمی مانند . مشخص شد که تنها دو مولکول از dsRNA در هر سلول قادر بودند که RNAi را برای یک ژن مانند unc22 که در C.elegans به فراوانی بیان می شود  القاء کنند . در گزارش دیگر تزریق dsRNA به روده C.elegans هرمافرودیت RNAi را ایجاد می کند که بطور پایدار به نسل بعدی یا F2 منتقل می شود این دو یافته منجر به پیشنهادی شد که می گوید سیگنال های RNAi می توانند در طبیعت سیستمیک و قابل تکثیر باشند .

مدارک مشابهی برای PTGS در گیاهان نیز در دسترس می باشد . هرگاه گیاه Brassica napus را که در آن ژن GUS بیان می شود را بر روی پایه ریشه داری از همین گیاه که در آن ژن GUS خاموش شده است پیوند بزنیم مشاهده می کنیم که در بافتهای جدیدی که از پیوندک رشد می کنند ژن GUS خاموش می شود .سیگنال یا پیغام خاموشی به نظر می رسد که بصورت غیر متابولیک و با یک سیگنال قابل نفوذ خاص ژنی انتقال می یابد که می تواند هم در بین سلولها از طریق

 پلاسمودسماتاها و هم در فواصل دور از طریق بافت آبکشی منتقل شود. در حالت خاموشی ژن القاء شده توسط ویروس ویژگیهای سیستمیک بودن آشکار شده است. پشنهاد این است که سیگنال می تواند یک مولکول RNA  و به احتمال قوی همان siRNA باشد